Gebrauchsanweisung für Säulen/Platten zur Entsalzung c18

Probenvorbereitung

Fügen Sie der Oligonukleotidprobe 0,5 M NacI hinzu, bis ein Volumen von 2 ml erreicht ist.

Aktivierung der Entsalzungssäule

Aktivierung: Zur Aktivierung der Säule wurde 1 ml Acetonitril verwendet.

Gleichgewichtseinstellung: Säule mit 1 ml 0,1 M TEAA-Lösung (pH 7,0) ausgleichen.

Reinigungsprozess

1. Leiten Sie 2 ml der Oligonukleotid-haltigen Lösung durch eine Entsalzungssäule.

2. Spülen Sie die Säule zweimal mit 1 ml Spüllösung, um erfolglose Sequenzen zu entfernen.

3. Spülen Sie die Säule zweimal mit 1 ml deionisiertem Wasser, um Salze zu entfernen.

4. Spülen Sie die Säule zweimal mit 1 ml 3%iger Trifluoressigsäure, um DMT zu entfernen, und beobachten Sie, wie sich die adsorbierte Schicht orangerot färbt.

5. Spülen Sie die Entsalzungssäule zweimal mit 1 ml deionisiertem Wasser, um Trifluoressigsäure und Restsalze zu entfernen.

6. 1 ml 20 % Acetonitril eluieren und zusammensetzen.

Probenvorbereitung

Fügen Sie der Oligonukleotidprobe 0,5 M NacI hinzu, bis ein Volumen von 4 ml erreicht ist.

Aktivierung der Entsalzungssäule

Aktivierung: Zur Aktivierung der Säule wurden 2 ml Acetonitril verwendet.

Gleichgewichtseinstellung: Eine 2-ml-Säule mit 0,1 M TEAA (pH 7,0) ausgleichen.

Reinigungsprozess

1. Leiten Sie 4 ml der Oligonukleotid-haltigen Lösung durch eine Entsalzungssäule.

2. Spülen Sie die Säule 2 Mal mit 2 ml Spüllösung, um erfolglose Sequenzen zu entfernen.

3. Spülen Sie die Säule 2 Mal mit 2 ml deionisiertem Wasser, um Salze zu entfernen ;)

4. Spülen Sie die Säule 2 Mal mit 2 ml 3%iger Trifluoressigsäure, um DMT zu entfernen. Die Adsorptionsschicht hat sich orangerot verfärbt.

5. Spülen Sie die Säule zweimal mit 2 ml deionisiertem Wasser, um Trifluoressigsäure und Salzrückstände zu entfernen.

6. 2 ml 20 % Acetonitril eluieren und zusammensetzen.

Probenvorbereitung

Fügen Sie der Oligonukleotidprobe 0,5 M Nac hinzu, bis ein Volumen von 10 ml erreicht ist.

Aktivierung der Entsalzungssäule

Aktivierung: Zur Aktivierung der Säule wurden 5 ml Acetonitril verwendet.

Gleichgewichtseinstellung: Die Säule wurde mit 10 ml 0,1 M TEAA (pH 7,0) ausgeglichen.

Reinigungsprozess

1. 10 ml einer Oligonukleotid-haltigen Lösung wurden durch eine Entsalzungssäule geleitet.

2. Die Säule wurde zweimal mit 5 ml Spüllösung gewaschen, um erfolglose Sequenzen zu entfernen.

3. Spülen Sie die Säule zweimal mit 5 ml deionisiertem Wasser, um Salze zu entfernen.

4. Waschen Sie die Säule zweimal mit 5 ml 3%iger Trifluoressigsäure, um DMT zu entfernen. Beachten Sie, dass die Adsorptionsschicht orangerot geworden ist.

5. Spülen Sie die Säule zweimal mit 5 ml deionisiertem Wasser, um Trifluoressigsäure und Salzrückstände zu entfernen.

6. 5 ml 20 % Acetonitril eluieren und sammeln.

Probenvorbereitung

Fügen Sie der Oligonukleotidprobe 0,5 M NaCl hinzu, bis ein Volumen von 0,5 ml erreicht ist.

Aktivierung von 96-Well-Platten

Aktivierung: 0,5 ml Acetonitril wurden durch jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geleitet.

Gleichgewicht: Äquilibrieren Sie eine 96-Well-Platte mit 0,5 ml 0,1 M TEAA-Lösung (pH 7,0).

Reinigungsvorgang

1. Lassen Sie 0,5 ml der Oligonukleotid-haltigen Lösung durch eine 96-Well-Platte laufen.

2. Spülen Sie die 96-Well-Platte zweimal mit 0,5 ml Waschlösung, um fehlerhafte Sequenzen zu entfernen.

3. Spülen Sie die 96-Well-Platte zweimal mit 0,5 ml deionisiertem Wasser, um Salze zu entfernen.

4. Waschen Sie die 96-Well-Platte zweimal mit 0,5 ml 3%iger Trifluoressigsäure, um DMT zu entfernen, und beobachten Sie, wie sich die Adsorptionsschicht orange-rot färbt.

5. Spülen Sie die 96-Well-Platte zweimal mit 0,5 ml deionisiertem Wasser, um Trifluoressigsäure und Salzrückstände zu entfernen.

6. Eluieren Sie 0,5 ml 20 % Acetonitril und sammeln Sie das Material.

Probenvorbereitung

Fügen Sie der Oligonukleotidprobe 0,5 M NaCl hinzu, bis ein Volumen von 1,2/2 ml erreicht ist.

Aktivierung von 96-Well-Platten

Aktivierung: Geben Sie 1–4 ml (0,5 ml) Acetonitril in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.

Gleichgewichtseinstellung: Gleichen Sie eine 96-Well-Platte mit 1–4 ml einer 0,5 ml 0,1 M TEAA-Lösung (pH 7,0) aus.

Reinigungsprozess

1. Lassen Sie 0,5–2 ml der Oligonukleotid-haltigen Lösung durch eine 96-Well-Platte laufen.

2. Spülen Sie die 96-Well-Platte 2 Mal mit 1/2 ml Waschlösung, um die unglücklichen Sequenzen zu entfernen ;)

3. Spülen Sie die 96-Well-Platte zweimal mit 1/2 ml deionisiertem Wasser, um Salze zu entfernen.

4. Waschen Sie die 96-Well-Platte zweimal mit 1/2 ml 3%iger Trifluoressigsäure, um DMT zu entfernen, und beobachten Sie, ob die Adsorptionsschicht orangerot wird.

5. Spülen Sie die 96-Well-Platte zweimal mit 1/2 ml deionisiertem Wasser, um Trifluoressigsäure und Salzrückstände zu entfernen.

6. 1/2 ml 20 % Acetonitril eluieren und das Material sammeln.

Reagens

Acetonitril, chromatographische Qualität

0,05 M TEE, PH 7,0

2 M TEE, PH 7,0

Deionisiertes Wasser (zur Entsalzung und Reinigung von RNA-Molekülen ohne RNase) 60 % Acetonitril (gelöst in Wasser mit 0,5 % NH4OH)

20 % Acetonitril (zur Entsalzung von DNA- oder RNA-Molekülen nach der Entschützung)

TE-Puffer: 10 mmol/L Tris-cla, 1 mmol/L EDTA, pH 8,0

Probenvorbereitung

HPLC-gereinigtes Oligo: Geben Sie eine entsprechende Menge 0,1 M TEAA zu den HPLC-gereinigten Oligos, sodass die endgültige Acetonitrilkonzentration ≤ 5 % beträgt. Gereinigte Oligos: Lösen Sie die Oligonukleotid-haltigen Gelfragmente in 0,05 M TEAA, entfernen Sie die Gelfragmente und lösen Sie das Oligo in mindestens 2 ml 0,1 M TEAA.

In NH4OH oder AMA gelöste Oligos: Bis zur Trockne eindampfen und in 2 ml 0,1 M TEAA auflösen.

Aktivieren der Entsalzungspumpe

Aktivierung: Zur Aktivierung der Säule wurde 1 ml Acetonitril verwendet.

Gleichgewichtseinstellung: Eine 1-ml-2-M-TEAA-Säule (pH 7,0) ausbalancieren.

Oligo-Entsalzungsverfahren zur HPLC-Reinigung

1. Leiten Sie die Oligonukleotid-haltige Lösung durch die Entsalzungssäule.

2. Spülen Sie die Entsalzungssäule zweimal mit 1 ml deionisiertem Wasser, um die Salze zu entfernen.

3. Durch eine Säule mit 1 ml 60 % Acetonitril eluieren und sammeln.

Entsalzungsverfahren für Oligos, gereinigt mit der PAAG-Methode

1. Leiten Sie die Oligonukleotid-haltige Lösung durch die Entsalzungssäule.

2. Spülen Sie die Entsalzungssäule zweimal mit 1 ml deionisiertem Wasser, um die Salze zu entfernen.

3. Durch eine Säule mit 1 ml 60 % Acetonitril eluieren und sammeln.

Verfahren zum Entsalzen von DNA-Oligonen nach der Synthese

1. Leiten Sie die Oligonukleotid-haltige Lösung durch die Entsalzungssäule; und

2. Spülen Sie die 1-ml-0,1-M-TEAA-Säule zweimal, um erfolglose Sequenzen zu entfernen.

3. Spülen Sie die Entsalzungssäule zweimal mit 1 ml deionisiertem Wasser, um die Salze zu entfernen.

4. Die Säule durch 1 ml 20 % Acetonitril leiten und zusammenbauen.

Entsalzungsverfahren für RNA-Oligos nach der Synthese

1. Leiten Sie die Oligonukleotid-haltige Lösung durch die Entsalzungssäule.

2. Spülen Sie die Säule mit 2 ml 0,1 M TEAA.

3. Spülen Sie die Säule mit 2 ml RNase-freiem Wasser.

In 20 % Acetonitril gelöste und bei 4 °C gelagerte Oligonukleotide verhindern das Wachstum von Mikroorganismen und eignen sich für die kurzfristige Lagerung.

Oligonukleotide in einer 20%igen Acetonitrillösung (oder gelöst in einem alkalischen Puffer wie TE) können bei Temperaturen von bis zu -20 °C lange Zeit gelagert werden.

Oligonukleotide in Form von lyophilisiertem Pulver sind lange lagerfähig.

Die verwendeten Reagenzienmengen stellen lediglich Empfehlungen dar und sollten im Einzelfall optimiert werden.

Die Entsalzungssäule muss ein ausreichendes Aktivierungsgleichgewicht durchlaufen, um die Rückstände auf der Säule/Platte zu eluieren und die Bindungskapazität der Säule/Entsalzungsplatte zu verbessern. Die Probenahme synthetisierter Oligonukleotide sollte langsam erfolgen, um zu verhindern, dass CPG-Pulver zur Reinigung in die Säule/Platte gelangt und eine Kreuzkontamination verursacht.

C18-Entsalzungssäulen/-Wafer verwenden eine Silicamatrix, der anwendbare pH-Bereich liegt zwischen 2 und 7, bei einem pH-Wert von > 7,5 löst sich die Silicamatrix leicht auf, bei einem pH-Wert von